Für die suborbitalen Flüge von Mercury-Redstone 3 und Mercury-Redstone 4 stand er als Ersatzpilot zur Verfügung und unterstützte dabei die Astronauten Alan Shepard und Virgil Grissom, denen er half, in das kleine Mercury-Raumschiff einzusteigen und letzte Tests vorzunehmen.
Am 20. Februar 1962 startete er als Pilot an der Spitze einer Atlas-Rakete von der Cape Canaveral Air Force Station in Florida zur Mercury-Atlas-6-Mission „Friendship 7“. Er umkreiste damit als erster US-Amerikaner drei Mal die Erde. Die gesamte Mission dauerte vier Stunden, 55 Minuten und 23 Sekunden.
Nach dem Flug wurde Glenn zum amerikanischen Idol aufgebaut. Präsident John F. Kennedy pflegte eine öffentlichkeitswirksame Freundschaft mit ihm, ordnete aber heimlich an, dass Glenn keine weiteren Raumflüge absolvieren durfte, um das Leben des Idols nicht aufs Spiel zu setzen. 1964 verließ Glenn die NASA und wurde Geschäftsführer einer Getränkefirma.
In der Folgezeit bewarb er sich mehrfach erfolglos um einen der Sitze seines Heimatstaates Ohio im Senat der Vereinigten Staaten. 1974 konnte er schließlich die Wahl für sich entscheiden und wurde 1980 mit großer Mehrheit wiedergewählt, ebenso 1986 und 1992. Glenn vertrat die Interessen Ohios bis 1999. 1984 bewarb er sich erfolglos um die Präsidentschaftskandidatur der Demokratischen Partei.
Vom 29. Oktober bis 7. November 1998 war Glenn im Rahmen der Space-Shuttle-Mission STS-95 mit der Raumfähre Discovery erneut im Weltraum, diesmal umkreiste er die Erde 134 Mal. Dabei sollte untersucht werden, wie sich die Schwerelosigkeit auf alte Menschen auswirkt. Mit 36 Jahren hält er damit den Rekord für die größte Zeitspanne zwischen zwei Raumflügen. Außerdem war er mit 77 Jahren der zu diesem Zeitpunkt älteste Raumfahrer im All. Diesen Rekord hielt er bis zum 20. Juli 2021, als die 82-jährige Wally Funk einen zehnminütigen Raumflug absolvierte. Nach wie vor ist Glenn der älteste Astronaut, der in den Erdorbit gelangt ist. Nach dem Tod von Scott Carpenter war er seit dem 11. Oktober 2013 der letzte lebende Mercury-Astronaut.
John Glenn heiratete am 6. April 1943 in New Concord Anna Margaret Castor. Die beiden kannten sich seit ihrer Kindheit. Sie bekamen zwei Kinder, einen Sohn (* 1945) und eine Tochter (* 1947).
John Glenn starb 8. Dezember 2016 in Columbus, Ohio und wurde am 6. April 2017 mit militärischen Ehren als Mitglied des United States Marine Corps in Anwesenheit seiner Witwe und der Kinder auf dem Arlington National Cemetery unter dem Kommando des CMC Robert B. Neller beigesetzt.
Seine Witwe Annie Glenn setzte sich für Menschen mit Sprachschwierigkeiten und anderen Behinderungen ein, stotterte selbst, verbesserte ihre Sprechfähigkeit im Alter von 53 Jahren durch Teilnahme an einem Kurs und starb im Mai 2020 100-jährig in einem Pflegeheim in Minnesota nach einer COVID-19-Infektion.